果树学报

2020, v.37(09) 1425-1433

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梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立
Establishment of rapid quantitative detection of viable Erwinia amylovora

袁英哲;韩剑;王岩;罗明;包慧芳;张春竹;黄伟;

摘要(Abstract):

【目的】将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×10~8CFU·mL~(-1)、PMA浓度为25μmol·L~(-1)、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%~100%时(浓度为6.0×10~7~6.0×10~8CFU·mL~(-1)),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系(R~2=0.992 8)。灵敏度检测结果表明,6.0×10~3~6.0×10~8CFU·mL~(-1)范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关(R~2=0.994 7),检测灵敏度下限为6×10~3CFU·mL~(-1)(12 CFU/qPCR反应)。用建立的PMA-qPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符。【结论】本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的"假阳性"。

关键词(KeyWords): 梨火疫病菌;叠氮溴化丙啶(PMA);实时荧光定量PCR(qPCR);活菌

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation):

作者(Author): 袁英哲;韩剑;王岩;罗明;包慧芳;张春竹;黄伟;

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DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20200056

参考文献(References):

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