果树学报

2020, v.37(01) 11-17

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应用枇杷二代测序数据进行染色体步移研究
A study on the use of next-generation sequencing data for genome walking in the loquat

蒋爽;安海山;徐芳杰;张学英;

摘要(Abstract):

【目的】枇杷基因组数据尚未公布,限制了枇杷分子生物学的研究。当前很多研究集中在上游转录因子和下游基因启动子之间的调控关系上,所以获得目的基因的启动子显得尤为重要。传统方法使用PCR方式进行染色体步移来获得启动子区域,耗时且难出结果。【方法】对‘火炬’枇杷进行二代测序,二代测序为双端测序,片段含盖200到500bp的序列。根据下游基因序列通过测序片段来实现染色体步移。使用现有程序Magicblast和新开发的Promoter_Scan脚本程序来快速获取目的基因启动子区域。Promoter_Scan对每对Reads构建10 bp的索引序列,先使用索引匹配目的基因,匹配后使用目的基因前30 bp序列再次匹配目标Reads,最后完成拼接。【结果】通过二代测序共获得61.77 GB的‘火炬’枇杷基因组数据,测序深度约为85倍。使用Magicblast检索匹配Reads耗时长,难以二次开发,需要手动拼接延伸,每个基因启动子挖掘需要9.5 h。新开发Promoter_Scan脚本程序通过两次匹配,能够更快更准确地找到启动子序列。对枇杷中8个基因进行启动子查找,向上延长2 000 bp序列平均需要拼接11.7次,耗时21.3 min。根据步移后的序列设计引物进行验证,结果显示:Sanger测序结果和预测的序列高度一致。【结论】使用Magicblast检索方式能够达到实验要求,不需要编程技能,但是耗时长。Promoter_Scan能够实现自动延伸,显著缩短启动子挖掘时间。本研究中的两种方法不仅可以用于枇杷分子生物学的研究,对其他未公布基因组数据的物种同样适用。

关键词(KeyWords): 枇杷;染色体歩移;启动子;二代测序;Reads

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 国家自然科学基金青年基金(31701886);; 上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字2015第6-2-2号)

作者(Author): 蒋爽;安海山;徐芳杰;张学英;

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DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20190296

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